Utvrđivanje srodnosti molekularno-biološkim metodama

Moderne metode molekularne biologije omogućuju jednostavnije, preciznije i izravnije određivanje srodnosti među pojedincima. Dok se tradicionalne metode temelje uglavnom na antropometriji (doslovno – mjerenje ljudi, utvrđivanje i uspoređivanje proporcija na temelju kojih je moguće nešto reći o srodnosti), moderna znanost koristi Mendeljejeve zakone nasljeđivanja kako bi odgovorila na pitanja srodnosti pojedinaca. Te metode, međutim, nisu idealne i ne mogu uvijek točno rekonstruirati nečije rodoslovno stablo, primjerice zbog nepostojanja živih srodnika, odnosno nemogućnosti nabavljanja bioloških uzoraka preminulih predaka i sl.. Metode se ugrubo mogu podijeliti u dvije kategorije – 1) one koje analiziraju genomsku DNA smještenu u jezgri na autosomima (kromosomima koji nisu spolni) i 2) one koje analiziraju DNA Y kromosoma (spolni kromosom karakterističan za muškarce), odnosno mitohondrijsku DNA (smještena u mitohondrijima, izvan stanične jezgre).

Genomska DNA

Za uspješnost ove metode potrebno je imati pristup uzorku tkiva (epitelne stanice usne šupljine, krv, korijen kose i sl.) živućih ljudi iz kojih je moguće izolirati DNA. Ponekad je moguće izolirati uzorke iz ljudskih ostataka, najčešće kostiju, zubi i sl. (ukoliko nisu previše degradirani). Ekstremni primjer je uspješna izolacija DNA iz 70 000 godina starih ostataka neandertalaca. Tehnike su jednostavne, izravne i ne zahtijevaju mnogo pretpostavki, osim najosnovnijih Mendeljejevih zakona nasljeđivanja koji objašnjavaju kako se određeni geni prenose s roditelja na potomstvo. Međutim, pošto genomska DNA tijekom mejoze prolazi kroz tzv. proces rekombinacije, mnogo nasljednog materijala biva izmiješano i praćenje nasljeđivanja određenih biljega kroz više generacija postaje vrlo teško i zamršeno.

U ljudskoj DNA postoje tzv. VNTR lokusi (Variable Number Tandem Repeat, varijabilne uzastopno ponavljajući sljedovi). Riječ je o kraćim ili duljim sekvencama DNA koje se uzastopno ponavljaju, a pojedinci se razliku u broju ponavljanja koja su u njih prisutna. Razlikujemo tzv. mikrosatelitne i minisatelitne DNA. U prvih sekvence kraće od pet nukleotida uzastopno se ponavljaju mnogo puta, dok su sekvence koje se ponavljaju kod minisatelita dulje od pet nukleotida (granica među mikrosatelitne i minisatelitne DNA je proizvoljna i nema nikakvo biološko značenje). Mikrosatelitne DNA još nazivamo STR (Short Tandem Repeats, kratke uzastopno ponavljajuće sekvence) ili SSR (Simple Sequence Repeats, jednostavne ponavljajuće sekvence). Ukoliko odjednom, paralelno gledamo mnogo različitih mikrosatelitnih lokusa („gena“) na različitim kromosomima, dobivamo specifični uzorak za svakog pojedinca. Vjerojatnost da će dvije nasumično odabrane osobe na Zemlji imati isti uzorak za 13 različitih lokusa je oko 1:1012.

Shema VNTR lokusa

Slika1. Shema VNTR lokusa; sljedovi uzastopno ponavljajuće DNA su okruženi sekvencama koje su specifične za određeni VNTR lokus na određenom kromosomu i identični su za isti lokus među različitim pojedincima. Ti jedinstveni, specifični sljedovi su označeni crno, dok su minisatelitni i mikrosatelitni uzastopno ponavljajući sljedovi označeni crveno. Razlika među pojedincima je isključivo u broju ponavljanja unutar lokusa. Ista simbolika je zadržana i na ostalim slikama (različiti VNTR lokusi na različitim kromosomima su označeni različitim bojama – crvenom i plavom).

VNTR lokusi se mogu istraživati s pomoću više različitih tehnika.

RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) analysis – analiza raznolikosti duljina restrikcijskih fragmenata

Tehnika zahtijeva mnogo izolirane DNA, koja se obrađuje posebnim enzimima (tzv. restrikcijskim endonukleazama) koji cijepaju DNA na specifičnim mjestima. Nakon obrade tim enzimima DNA će biti pocijepana na fragmente čija će duljina ovisiti o broju ponavljanja VNTR sekvenci. Te fragmente onda možemo razdvojiti zbog razlike u duljini, te posebnom tehnikom (Southern blot) učiniti vidljivima. Pojedinci imaju različite fragmente različitih duljina (zbog razlika u broju ponavljanja) i tako ih možemo razlikovati. U stvarnosti, to izgleda kao individualni barkod.

RFLP analiza

Slika 2. RFLP analiza, VNTR sljedovi se cijepaju enzimima na specifičnim mjestima (označeno trokutićima) te tako nastali fragmenti razdvajaju i vizualiziraju kako bi se otkrio jedinstveni uzorak za određenu osobu. Prema Mendeljejevim zakonima nasljeđivanja, može se odrediti srodnost među osobama budući da samo roditelji mogu prenijeti određeni alel (oblik gena, odnosno u ovom slučaju, broj ponavljanja unutar VNTR lokusa) na potomstvo.

PCR (Polymarase Chain Reaction) analysis – analiza lančanom reakcijom polimeraze

VNTR lokuse, osim gore navedenom tehnikom, moguće je analizirati i PCR-om. U ovom slučaju nije potrebno izolirati mnogo DNA, jer se pomoću enzima polimeraze već iz vrlo malih količina DNA može dobiti mnogo umnoženih dijelova. Umjesto da DNA restrikcijskim enzimima na specifičnim mjestima cijepamo, možemo umjesto toga pomoću enzima polimeraze, opet na specifičnim mjestima, umnožiti je. Tako specifično umnožene fragmente možemo također razdvojiti na temelju razlike u duljini, obojiti bojom za DNA (etidijev bromid) i vidjeti. Rezultat je sličan onome u gore navedenoj tehnici.

PCR analiza

Slika 3. PCR analiza, VNTR sljedovi se polimerazom umnožavaju na specifičnim mjestima (označeno strelicama), a fragmenti nastali reakcijom se jednostavno vizualiziraju etidijevim bromidom. Uzorak je sličan onome iz RFLP analize.

AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) analysis – analiza raznolikosti duljina PCR-om umnoženih fragmenata DNA

Još jedna tehnika koja ima neke sličnosti i s RFLP i PCR analizom. DNA se prvo obrađuje restrikcijskim enzimima koji će je specifično pocijepati kao u prvoj tehnici, no nakon toga ne slijedi odmah analiza, već PCR kojim će se samo neki određeni tako nastali fragmenti umnožiti slično kao u drugoj tehnici. Tek nakon toga slijedi analiza. Metoda je vrlo moćna, jeftina i informativna. Rezultat je ponovno uzorak koji je karakterističan za pojedinca, no u ovom slučaju se češće primjenjuje automatizirano razdvajanje fragmenata različite duljine.

AFLP analiza

Slika 4. AFLP analiza, nešto je kompliciranija metoda, ali vrlo moćno oruđe u analizi srodnosti. Nakon prvog cijepanja slijedi umnožavanje DNA u PCR reakciji. Ovdje je specifične fragmente također moguće vizualizirati kao i u prve dvije tehnike, no najčešće se ipak upotrebljava automatsko razdvajanje posebnim uređajem (rezultat je grafički prikaz, kao na slici desno).

Y kromosom i mitohondrijska DNA

Iako je Y kromosom dio genomske DNA, specifičnost ove tehnike se temelje na činjenici da se Y kromosom nepromijenjen nasljeđuje isključivo s oca na sinove. Ostali kromosomi (autosomi) tijekom mejoze prolaze kroz proces rekombinacije, odnosno miješanja genetskog materijala među homolognim kromosomima (tijekom mejoze, jedan kromosom naslijeđen od oca i jedan od majke miješaju svoje nasljedni materijal; zbog toga je istraživanje srodnosti kroz više generacija često otežano). Kod Y kromosoma (koji je spolni kromosom) se to ne događa, već se gotovo kompletan kromosom prenosi nepromijenjen na sljedeću generaciju. Mitohondrijske DNA se uopće ne nalazi u jezgri i uopće ne prolazi kroz proces mejoze i rekombinacije te se nepromijenjena nasljeđuje s majke na njeno potomstvo. No samo žensko potomstvo može mitohondrijsku DNA prenijeti i dalje, na sljedeću generaciju; muškarci svoju mitohondrijsku DNA naslijeđenu od majke i ne mogu prenijeti na svoje potomke.

Slika 5. a) (lijevo) Nasljeđivanje Y kromosoma i mitohondrijske DNA (specifični Y kromosom i mitohondrijska DNA su označeni različitim bojama), svi muškarci nasljeđuju Y kromosom od oca i prenose ga isključivo na sinove, dok mitohondrijsku DNA nasljeđuju od majke, ali je ne prenose dalje. Žene nasljeđuju samo mitohondrijsku DNA od svojih majki i prenose je dalje na potomstvo, no njihovi sinovi ne prenose tu mitohondrijsku DNA dalje.

Slika 5. b) (desno) Shematski prikaz Y kromosoma i mitohondrijske DNA i nasljeđivanje specifičnih mutacija (označene različitim bojama).

Analiza Y kromosoma

Y kromosom je karakterističan za muškarce, nasljeđuje se nepromijenjen, isključivo s oca na sina. Jedine promjene koje se na njemu eventualno mogu dogoditi su mutacije – nasumične zamjene pojedinog nukleotida koje se događaju slučajno, spontano i vrlo rijetko. Na Y kromosomu se također nalaze VNTR lokusi. Ukoliko se analiziraju određeni dijelovi Y kromosoma više različitih muškaraca, oni mogu biti vrlo slični ili čak identični. No ipak, mogu postojati i određene razlike među njima, ukoliko je kod nekog od muških predaka došlo do neke određene promjene koja je onda bila naslijeđena i prenesena na sinove te se održala do danas. Na temelju tih promjena moguće je odrediti srodnost po muškoj liniji.

Analiza mitohondrijske DNA

Mitohondrijska DNA, smještena unutar mitohondrija, nasljeđuje se isključivo po ženskoj liniji, no, pošto su mitohondriji presudni za opskrbu stanica energijom, imaju ih i muškarci i žene. Tako je moguće odrediti ženske pretke. Tehnika je jednostavna; izolirana mitohondrijska DNA se umnoži u PCR reakciji i tako dobiveni umnoženi dijelovi se sekvenciraju (određuje im se slijed baza u DNA) te, primjerice, ukoliko postoje razlike između sekvence osobe koja se testira i hipotetskog pretka po majčinoj liniji, srodnost se može isključiti. Ukoliko su sekvence identične, vjerojatnost srodnosti je vrlo visoka.

Važno je naglasiti da sve ovdje navedene tehnike mogu apsolutno isključiti srodnost, no dokazati srodnost je moguće samo do neke određene (vrlo visoke) statističke vjerojatnosti.

Marin Ježić

Doktor je molekularne biologije. Radi kao asistent unutar istraživačke skupine za molekularnu mikrobiologiju Botaničkog zavoda Prirodoslovno-matematičkog fakulteta u Zagrebu.

Možda vam se svidi

3 komentara

  1. Mia says:

    Poštovanje!
     
    Zanima me da li s ei na koji način može utvrditi očinstvo, posthumno….Naime, nedavno sam saznala ime svoga oca, koji je preminuo prije dosta godina. Ima živuće potomke, jednog sina, unuka i unuku toga sina te još dva muška unuka od drugog sina koji je također mrtav. Naravno, otac me za života nije priznao, pa time gubim sva prava koja me zakonom pripadaju, a to ometa i svaki pokušaj prikupljanja dodatnih podataka…o njemu i sl. Ima razloga vjerovati da je upravo on moj otac, jer iako su mi godinama lagali svi iz moje obitelji, druge činjenice do kojih sam došla ukazuju da je On. Sada zanima me kako i na koji način doći do uzoraka za analizu, a pri tome ne mislim nužno s zakonske strane, jer smatram da će bilo koji sudac donijeti odluku o ekshumaciji njegovih posmrtnih ostataka  a vjerujem i da sa strane njegove obitelji (supruge, sina i unučadi) ne bih došla na odobravanje, odnosno realno očekujem otvoreno neprijateljstvo i poricanje .. Stoga od presudne mi je važnosti znati koje uzorke i od koga da uzmem, tj. da li je moguća analiza mitohondrijske DNA, npr. od unuke jer mislim da je jedini živi srodnik ženskog spola … obzirom da do njegovih uzoraka trenutno ne mogu doći (potrebna je ekshumacija, naravno)… .. i da li se tim postupkom može utvrditi očinstvo ??? Također me zanima da li u tome slučaju moram pribaviti i majčin uzorak, radi lakše eliminacije dijela DNA koji sam naslijedila od nje???? Naravno i koliko to sve na kraju košta???
     
    Zahvalna …
     
    P.S.
    Razočarana sam i frustirana jer nitko nije na mojoj strani…i svi su mi lagali,a  to namjeravaju i dalje …Stoga, nemam mira dok ne otkrijem istinu …
     
    Srdačan pozdrav

  2. Neny says:

    Postovani 
    Ja bih Vas lijepo molila ako mi mozete odgovoriti na moj mail u vezi utvrdjivanja srodnosti na slijedeca pitanja:
    koji je najmjerodavniji nacin za utvrdjivanje srodstva  po krvnoj vezi,  izmedju zivih osoba i  onih koji su mrtvi  vise od par stotina godina, a u svrhu dokazivanja porijekla, kao i koja je procedura za pokretanje istog postupka.
    Unaprijed najljepse zahvaljujem
    Neny

  3. vjera says:

    Da li se za utvrdjivanja srodstva radi jedna analiza,a za nesrodnike druga.Koliko lokusa je identicnih moraju imati za blisko srodstvo,a koliko za dalje srodstvo, kakva je razlika ako je je 15 za nesrodnike.Da li 11 istih lokusa daje mogucnost srodstva, i kakvog
     
    Hvala puno Vjera

Komentirajte!

Your email address will not be published. Required fields are marked *